手性固定相在高效液相色譜（HPLC）中扮演著實現對映體拆分的關鍵角色。其中，蛋白質類手性固定相因其獨特的性質而備受關注。今天小研帶大家一起來了解一下這類獨特的蛋白質類手性固定相~

蛋白質（protein）根據20種氨基酸側鏈R基團的極性，可將其分為非極性R基氨基酸（8種)、不帶電荷的極性R基氨基酸（7種）、帶負電荷的R基氨基酸（2種）和帶正電荷的R基氨基酸（3種）。

自然界的生命存在于由生物大分子組成的手性環(huán)境中，酶和受體系統總是顯示出對映體選擇性或立體選擇性。蛋白質是一類復雜的高分子聚合物，所含亞單位L-氨基酸具有手性特異性，能特異性地結合小分子，因此對手性分子具有很強的識別能力。然而，只有有限的一些蛋白質被系統研究而被制備成手性固定相。

目前，用于手性拆分的蛋白質按其來源可分為:

白蛋白類：包括牛血清蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)；

1.1 牛血清蛋白（BSA）

牛血清蛋白

牛血清蛋白（BSA）是球狀蛋白，由581個氨基酸組成的單鏈，鏈內有17個二硫橋鍵，分子量為66210，分子量較小、溶解性較大、穩(wěn)定性較好、和各種配體的親合性較好、易于分離提純和大量制備；更為重要的是牛血清蛋白具有對某些氨基酸衍生物和藥物異構體可提供手性位點，手性藥物對映異構體與手性位點可能產生不同作用力，如氫鍵疏水效應和靜電作用等，進而實現對映體拆分，從而被用于HPLC手性分離。

以廣州研創(chuàng)獨家專利產品——EnantioPak? BSA牛血清蛋白手性色譜柱為例，它是反相專用柱，其固定相是牛血清蛋白，適用于水溶性化合物、氨基酸類、伯胺類的測定。

EnantioPak? BSA也是甲氨蝶呤的專用柱，根據《中國藥典2020年版》中甲氨蝶呤的檢測方法，用牛血清蛋白手性色譜柱可檢測其光學純度，使用廣州研創(chuàng)EnantioPak? BSA按照高效液相色譜法做了全面的驗證，在標準條件下，可滿足檢測要求。

廣州研創(chuàng)專利的這款EnantioPak? BSA牛血清蛋白柱除了可以用于檢測甲氨蝶呤，還可用于拆分酒石酸鹽、磷酸奧硝唑酯二鈉、甲基四氫葉酸鈣、匹多莫德、色氨酸、磷酸特地唑胺、惡唑烷酮類抗菌劑等等。目前主要有分析柱及保護柱，可以去根據實驗要求去選擇。（詳情請咨詢18922204815）

1.2人血清白蛋白(HSA)

人血清白蛋白(HSA)與 BSA 的性質非常相似，HSA 也是一種球狀蛋白，分子量為 66437，等電點為4.7，它是一條含有17個鏈內二硫鍵的單肽鏈。它能拆分一些弱酸或中性化合物的對映異構體，其中包括芳基丙酸類非甾體抗炎類藥物，還原葉酸如亞葉酸5-甲基四氫葉酸，苯并二氮草如去甲羥基安定、羥基安定和勞拉西泮。

②糖蛋白類：包括α1-酸性糖蛋白(α1-AGP)、卵類黏蛋白(OVM)和卵蛋白(AVI)、黃素蛋白(FP)；

2.1α1-酸性糖蛋白(α1-AGP)

α1-酸性糖蛋白是由181個氨基酸和5個雜多糖組成的單鏈多肽，包含14個唾液酸殘基，平均分子量為33000，糖含量約34%。因其較低的等電點（pl 2.7)，成為結合陽離子藥物的主要血漿蛋白。許多堿性、中性和酸性對映體都能在AGP柱上得到拆分。

2.2卵類黏蛋白(OVM)

卵類粘蛋白也被用作手性固定相。雞卵類黏蛋白作為蛋白質手性固定相可以拆分藥物和體液中的酸、堿、中性對映異構體化合物。該柱的穩(wěn)定性優(yōu)于其他蛋白質類手性固定相。

③酶類：包括纖維素酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、葡聚糖纖維二糖水解酶(CBH)、胃蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、溶菌酶；

3.1纖維素酶

纖維素酶是具有不同的結構但都具有水解1,4-糖苷鍵功能的一組酶家族。由真菌瑞氏木霉產生的纖維素酶 CBH I和CBH II 為酸糖蛋白。CBH I固定相能拆分酸性、堿性及不帶電荷的消旋體，對于拆分受體阻斷劑選擇性尤其高。而CBH II對β-受體阻斷劑選擇性不如CBH I，但能拆分其他的消旋體。

3.2胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶

兩者都屬絲氨酸蛋白酶家族、催化氨基化合物和脂類對映體的選擇性水解。胰蛋白酶固定相能拆分O-和N,O-衍生化的氫基酸，這兩類氨基酸都是該酶的底物，手性識別位點也正位于酶的活性中心，這提示立體選擇性拆分是酶的活性作用的結果。α-凝乳蛋白酶 固定相能拆分氨基酸、氨基酸生生物、二肽及其他的一些化合物如萘普生和芳氧基丙酸類。

3.3淀粉葡萄糖苷酶

淀粉葡萄糖苷酶能對幾種β-受體阻斷劑的消旋體進行拆分，流動相pH>6有助于提高拆分選擇性。

3.4胃蛋白酶和溶菌酶

這兩種蛋白的固定相均能拆分堿性和不帶電的對映體，但不能拆分酸性對映體。當流動相pH>7時，胃蛋白酶柱會失去手性識別特性并發(fā)生不可逆性的變性。

④其他蛋白：卵傳鐵蛋白和β-乳球蛋白。

多數蛋白質類手性固定相的分離機制目前尚不十分清楚，但是蛋白質類手性固定相的手性識別能力可以歸結為它們獨特的一、二和三級結構特征。尤其是在對映體的手性識別過程中，三級結構所創(chuàng)造的疏水性口袋、溝槽或通道對非對映絡合物的形成常常是十分重要的。

蛋白質類手性固定相的作用機制主要是通過疏水和極性相互作用進行手性拆分。當對映體進入色譜柱后，它們會與固定相上的蛋白質發(fā)生相互作用。由于蛋白質的手性識別能力，不同的對映體會與蛋白質形成不同的結合方式和強度，從而實現手性拆分。

四、影響蛋白質手性固定相拆分效果的因素

蛋白質的空間結構在很大程度上影響其立體選擇性，因而其固定化狀況極大地影響手性藥物的拆分。同時由于蛋白質易變性，通常只能用溫和的水相緩沖液作流動相，對柱溫也有一定的要求。

1.固定化狀況 

固定化方法、載體的物理性質、鍵合反應基團的空間長度、鍵合到柱載體上的蛋白質的量以及蛋白質提取和純化方法等均影響固定相的手性選擇性。蛋白質固定化方法可影響蛋白質提供的手性識別位點，并使其與對映體間產生不同的疏水作用。如將BSA 鍵合到硅膠上比吸附到硅膠上更具手性選擇性。載體硅膠的孔徑、鍵合反應基團的空間長度會直接影響鍵合到柱載體上的蛋白質的量，可能導致不同程度的手性或非手性作用其中手性作用源于蛋白質提供的手性識別位點，非手性作用來自于未被覆蓋的載體基團。

2.流動相的pH值 

流動相的pH值是一個最重要的參數，它不僅決定了溶質的電離程度，同時會改變蛋白質分子的三維結構影響其親和性和手性特性。若溶質離子化程度減少，與固定相的親和力就會增加保留值增加。

3.有機改性劑 

在流動相中加入少量改性劑能影響溶質在柱上保留行為和手性作用，這是改性劑和溶質競爭固定相上鍵結合位點或者改變蛋白質疏水性的結果。常用的改性劑可分為四類：中性有機改性劑，如乙醇、丙醇、乙腈等陽離子有機改性劑。

4.色譜柱溫度

升高柱溫可增加理論塔板數，改善柱效。但同時，柱溫變化可改變離子平衡狀況，如改變溶質的電離狀態(tài)、導致蛋白質固定相結構改變等，最終改變溶質同固定相的手性作用力。

下期預告：刷型手性固定相，敬請期待~